在基因编辑领域，如何在完成目标基因编辑后彻底清除CRISPR转基因组件，一直是困扰科研人员的技术难题。
近日，中国农业科学院作物科学研究所/国家南繁研究院作物精准育种技术创新团队联合华中农业大学水稻团队在《Plant Biotechnology Journal》发表重磅研究：‘’Transgene-Killer-CRISPR version 2 (TKC2) eliminates occasional transgene escape by coupling with a RUBY reporter‘’，推出了转基因杀手CRISPR 2.0版本（TKC2），在解决转基因残留问题上实现了革命性突破。
回顾一下背景：该团队此前开发的第一代TKC（Transgene Killer CRISPR）技术，通过"自杀盒"策略实现转基因的自我消除，已经是业内领先的解决方案。但在实际应用中，研究人员发现了一个关键问题——仍有少量T1代植物保留转基因成分，存在"转基因逃逸"现象。
这个看似微小的问题，实际上关乎整个技术的实用性。因为即使只有很少的转基因残留，也会影响基因编辑植物的商业化应用和监管审批。
TKC2最大的创新在于引入了RUBY报告基因。RUBY是一个能够将酪氨酸转化为鲜艳红色花青素的基因，为转基因监测提供了直观的可视化标记。
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使用单一启动子（CmYLCV-35S复合启动子）；
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通过内含子中的tRNA-gRNA-核酶（inTGR）结构释放gRNA。
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转基因存在指示器：红色植物=含转基因，绿色植物=无转基因；
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编辑效率指示器：RUBY表达水平与Cas9/gRNA表达正相关。
研究数据证实了这一设计的有效性：在T0代中，红色转基因植物的编辑效率达到89.61%-95.83%，而绿色转基因植物仅为67.84%-69.66%（图2c）。
团队开发了四个不同的TKC2系统（图2a），每个都包含两个"自杀盒"：
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TKC2.1：35S::CMS2 + REG2::BARNASE；
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TKC2.2：ZmPG47::ZmAA1 + REG2::BARNASE；
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TKC2.3：ZmPG47::ZmAA1 + LTP2::BARNASE；
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TKC2.4：ZmPG47::ZmAA1 + NF-YB1::BARNASE；
TKC2的效率提升是显著的。让我们看看关键数据（图3）：
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TKC2.1和TKC2.2：96-99%的转基因消除率；
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TKC2.3和TKC2.4：73-94%的转基因消除率；
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对比RUBY-CRISPR（无TKC）：仅26-29%。
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更令人惊喜的是，当只考虑绿色（无RUBY）植物时：所有TKC2系统都达到了96-100%的转基因消除率；
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在TKC2-YSA实验中，473个绿色T1植物的转基因消除率达到100%。
这意味着，通过RUBY颜色筛选，研究人员可以轻松识别并避开转基因逃逸植物。
为了验证PCR检测结果的准确性，研究团队对32个样本进行了全基因组测序（WGS）。结果显示（图4）：
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24个被判定为无转基因的绿色植物中，WGS确认全部无转基因片段；
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4个转基因RUBY植物中，WGS确认全部含有转基因序列；
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TKC2还解决了一个重要问题：基因编辑的稳定遗传。
从图3d的分离模式分析可以看出，T0植物的嵌合性质得到了清晰展现。例如，T0植物#2-SE5-2产生了三种不同的等位基因（21bp缺失、2bp缺失和野生型），说明该T0植物是嵌合体。
关键意义：如果不消除基因编辑组件，很难判断T1代的新突变是遗传自T0代还是由残留的Cas9新产生的。TKC2通过彻底消除转基因，确保了突变谱系的清晰可追溯。
相比传统方法，TKC2具有明显优势：操作简便，无需复杂的PCR筛选，通过肉眼观察即可判断；效率极高，转基因消除率接近100%；环境友好，避免转基因花粉或种子释放到环境中；监管友好，符合转基因生物相关法规要求。
该技术已在水稻上得到验证，团队表示RUBY基因已在多个植物物种中成功应用，预示着TKC2技术具有广阔的跨物种应用前景。
对于基因编辑的产业化应用而言，TKC2提供了一个几乎完美的解决方案。它让基因编辑作物的监管审批变得更加可行，为基因编辑技术的广泛应用扫除了重要障碍。
华中农大已毕业博士生朱敏为论文第一作者，作科所/南繁院和玉兵副教授为论文通讯作者。中国农科院团队首席夏兰琴研究员、加州大学圣地亚哥分校赵云德教授和华中农业大学作物遗传改良全国重点实验室熊立仲教授为该研究做出了重要指导。该研究得到国家自然科学基金、中国农科院青年专项、南繁专项、海南崖洲湾种业实验室揭榜挂帅项目等资助。
