近日，中国农业科学院作物科学研究所/国家南繁研究院作物精准育种技术创新团队联合华中农业大学水稻团队在《Plant Biotechnology Journal》发表研究论文：‘’TKC-MC: an Effective Strategy for Generating Heritable Heterozygous Mutations in Essential Genes in Rice‘’，成功开发了一种名为“转基因自杀介导的错配靶向鸡尾酒策略”（TKC-MC）的新型基因编辑方法，TKC-MC成功解决了功能缺失纯合致死或不育突变无法稳定传代难题，为深入解析这类“必需基因”的功能和育种应用提供了有效的技术工具。

目前，CRISPR/Cas9技术的兴起使得创制突变体变得常规化，这为遗传材料的创制带来了极大地便利。但是因为常规的CRISPR/Cas9技术是将Cas9和gRNA的表达框在水稻细胞中进行超量表达，过量的Cas9/gRNA复合体会对水稻细胞中的靶基因进行持续切割，直到细胞中的等位靶基因均发生突变为止（纯合或双等位突变）。因此在水稻中产生非完全编辑的突变体概率较低，使得常规CRISPR/Cas9基因编辑技术在纯合缺失突变无法传代类基因（致死或不育基因）的突变体创制中存在较大困难，尤其是在规模化的突变体库创制中，这类基因往往无法拿到突变体材料。前人的研究发现常规CRISPR/Cas9基因编辑仅能产生5%左右的不完全编辑突变（杂合或者嵌合突变体） (Ma et al., 2015; He et al., 2019; 2020)。由此可知在创制一些纯合缺失突变致死或不育基因的突变体时，若通过常规的CRISPR/Cas9基因编辑技术将会耗费大量的研究时间来获取可有效传代的非完全编辑突变体材料，如完全雌性不育突变体ospid（He et al., 2019）。而且在进行饱和突变体库创制时，势必无法很好覆盖到一些对植物生长发育有决定性作用的重要基因。

该研究基于前期基因编辑技术，经过对gRNA的Spacer区域的关键错配位点分析与筛选并根据靶点特性分类，提出了TKC介导的错配靶向鸡尾酒策略（TKC-MC）。TKC-MC无需预先了解靶点特性，可通用于任何必需基因，改策略将携带完全匹配、单碱基错配和双碱基错配三种不同gRNA的TKC载体工程菌液等比例混合后共同转化水稻。该方法巧妙之处在于“一石二鸟”：1）“提升不完全编辑比例”：通过精准设计向导RNA的“错配”序列，适度降低基因编辑效率，显著提高获得可存活的不完全编辑突变体的比例。2）“自我清除”：利用团队此前开发的“转基因自清除”技术，让编辑组件在完成任务后自动从后代中消失，从而将有益的杂合突变“锁定”并稳定遗传下去。TKC-MC操作通用简便，并且可将可遗传不完全编辑突变体的获得效率稳定提升至11%-20%，是传统方法的6倍以上（图1）。本研究开发了适用于纯合突变无法传代类基因的CRISPR/Cas9基因编辑技术。为一些致死或不育突变体材料的创制和传代，如雄性不育甚至雌性不育遗传材料，以及构建水稻的饱和突变体库提供有力地技术支持。

图1. Spacer区域的关键错配位点筛选及TKC-MC的应用与工作流程示意图

作物精准育种技术创新团队和玉兵副教授为论文通讯作者。团队首席夏兰琴研究员为该研究做出了重要指导。该研究得到了农业生物育种重大专项、中国农业科学院南繁专项、中国农业科学院青年创新专项等项目的资助。

文章链接：http://doi.org/10.1111/pbi.70472