近日，Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了由中国农业科学院国家南繁研究院、生物技术研究所、浙江师范大学以及烟草研究所团队合作的研究文章“A GhBGH2-GhGLK1 regulatory module mediates salt tolerance in cotton”。该研究从棉花中鉴定到一个新的耐盐相关基因GhBGH2。基于CRISPR/Cas9生成了bgh2敲除突变体，盐胁迫处理发现其耐盐性显著提高。通过转录组测序和酵母双杂交筛选到了GhBGH2的互作蛋白GhGLK1。GhGLK1正调控棉花耐盐性。Y1H、LUC和EMSA证实GhGLK1通过与下游耐盐基因启动子中的G-box元件结合并激活其转录，从而提高棉花耐盐性。GhGLK1的结构分析表明转录激活结构域位于其C端，酵母异源表达以及免疫共沉淀（Co-IP）测定表明GhBGH2与该结构域相互作用。GhGLK1单倍型分析发现，在中国西北盐碱区富集了明显的Hap-1变异。该变异表为现GhGLK1表达水平上升并伴随更强的耐盐性。研究结果表明，GhBGH2通过与GhGLK1激活结构域相互作用，负向调控棉花的耐盐性，抑制其对耐盐基因的转录调控。这一发现为解析植物耐盐分子机制提供了新的视角，并为棉花耐盐遗传改良提供了理论支持和基因资源。

Brz不敏感淡绿色（bpg）基因家族调节芸苔素类固醇（BR）信号传导下游的叶绿体功能，包括BPG1、BPG2、BGP3和BPG4（Tachibana et al., 2022；Komatsu et al., 2010；Yoshizawa et al., 2014）。BPG4同源基因2（BGH2）与BPG4同源，与叶绿体发育有关（Tachibana et al., 2024）。Golden2-Like（GLK）转录因子属于GARP（Golden2、ARR-B、Psr1）超家族，由三个亚家族组成。之前的研究发现转录因子GLK在叶绿体发育过程、光合作用、生物反应等不同的生物过程都发挥了重要作用。大多数GLK基因包含两个保守结构域：一个Myb-DNA结合结构域（包括一个螺旋-环-螺旋基序）和一个C端结构域（具有保守的GCT盒）（Kreps et al., 2002；Tamai et al., 2002）。GLK转录因子最初被确定为叶绿体发育的关键调节因子，现在已知它们可以上调与光合作用光系统相关的基因，从而促进叶绿体功能（Nakamura et al., 2009）。在拟南芥中，GLK启动子含有与植物激素、光合作用和胁迫反应相关的元素。AtGLK基因成员参与金属离子运输，有助于耐旱、寒冷和渗透胁迫（Alam et al., 2022）。拟南芥glk1/glk2双突变体中花生GLK的过表达可将抗旱性恢复到野生型水平（Liu et al., 2020）。在棉花中，GLK1沉默导致在寒冷和干旱胁迫下更严重的叶片枯萎，而拟南芥中GLK1的过表达会增强对这些胁迫源的耐受性（Liu et al., 2021）。

 在之前的研究中，我们选择了HN4（耐盐）和CJ-A3（耐盐）两个品种，并在苗期对它们进行不同的NaCl浓度处理。通过RNA-seq确定与耐盐性相关的DEGs（Wang et al., 2023）。通过富集分析筛选了耐盐相关的负调控基因，并鉴定了在盐胁迫下HN4和CJ-A3下调的Gh_D04G136300。系统发育分析表明，Gh_D04G136300与拟南芥AtBGH2最紧密地聚集在一起，因此我们将其命名为GhBGH2。进一步的序列分析表明，GhBGH2具有高度保守的A_thal_3526结构域，表明跨物种的功能保守。我们通过VIGS沉默GhBGH2并用200 mM NaCl处理，与对照相比，TRV::GhBGH2植株的枯萎显著减少，表明耐盐性增强。此外，关键抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）在盐胁迫下在TRV::GhBGH2植株中表现出更高的活性，表明抗氧化应激性有所提高。

图1. GhBGH2基因鉴定、进化和功能分析

鉴于GhBGH2沉默赋予了棉花耐盐性，研究进一步评估了200 mM NaCl下bgh2突变体的耐盐性。正常条件下的发芽率与野生型（WT）相当，但在盐胁迫下，bgh2种子的发芽率明显高于WT对照。此外，当4-6株真叶期幼苗用400 mM NaCl处理15天时，WT植株表现出严重的枯萎，而bgh2突变体仅表现出轻微的症状。在盐胁迫下，与WT相比，bgh2突变体的根更长，侧根更多，主根更粗，枝条和根生物量均显著升高。此外，bgh2突变体中的SOD和CAT活性显著高于对照。根据中国农业科学院棉花研究所的耐盐性鉴定分析，盐胁迫下bgh2两株系的田间成活率分别为0.5799和0.7427，表现出较好的耐盐性。

图2. 敲除 GhBGH2 可增强棉花的耐盐性

酵母双杂交筛选，结合转录组测序和GO/KEGG通路分析，确定转录因子GhGLK1是GhBGH2的潜在互作蛋白。酵母双杂交测定证实GhBGH2与GhGLK1发生物理相互作用。亚细胞定位分析表明，GhBGH2定位于细胞核和细胞膜，而GhGLK1仅存在于细胞核。在烟草中利用BiFC测定进一步证实了GhBGH2和GhGLK1的核相互作用。基于AlphaFold3的结构预测（Abramson et al., 2024）将GhBGH2-GhGLK1相互作用位点定位到蓝色结构域，对应于GhGLK1的C端区域。为了描绘特定的相互作用区域，将GhGLK1分为四个片段：1-114 aa、115-230 aa、231-329 aa和330-423 aa。酵母双杂交测定表明，GhBGH2与C端区域的GCT盒相互作用。免疫共沉淀（Co-IP）证实了与GCT盒结构域的相互作用。

图3. GhBGH2 与 GhGLK1 的转录激活结构域相互作用

为了进一步解析GhGLK1的功能，通过VIGS沉默GhGLK1。沉默7 d后，对植株进行200 mM NaCl处理。到第12天，TRV::GLK1植物在TRV::00之前表现出严重的萎蔫。此外，TRV::GLK1植株中的SOD和CAT活性显著降低，表明氧化应激敏感性增加。有趣的是，虽然GhBGH2负调节耐盐性，但GhGLK1起到正调节作用。为了进一步评估GhGLK1功能，在幼苗期对过表达GLK1/2和glk1/glk2突变体的拟南芥品系进行100 mM NaCl的处理。与对照和glk1/2突变体相比，过表达系表现出更高的耐盐性。过表达系的相对存活率和相对含水量也显著升高，而MDA水平较低，表明氧化损伤减少。通过农杆菌介导的遗传转化，产生了3个棉花过表达株系。在田间条件下，800 mM NaCl处理三周导致对照植物（Z49）出现严重的矮化和叶片萎黄。然而，过表达株系中每株棉铃重量和总棉铃重量均显著高于Z49，表明转基因棉花的耐盐性增强。

图4. 过表达GhGLK1 增强棉花耐盐性

先前的研究表明，GLK转录因子结合基因启动子中的G-box元件。值得注意的是，耐盐相关基因GhGOLS2、GhPYR1、GhNAC002和GhSWEET15含有一个G-box，而GhLTI65和GhNTAQ1分别含有两个和三个。双荧光素酶测定证实GhGLK1通过G-box元件激活上述基因的转录。与对照组相比，用3×G-box-LUC感染62-SK-GhGLK1显著增加了LUC荧光和LUC/REN比率。酵母单杂交测定证实了GhGLK1与G-box的直接结合。EMSA表明GhGLK1-GST特异性地与G-BOX基序（CCAATC）结合。对Z49、bgh2和TRV::GLK1植物中GhLTI65表达的RT-qPCR分析表明，GhLTI65在bgh2中上调，在TRV::GLK1中下调，特别是在盐胁迫下。鉴于GhGLK1在bgh2突变体中表达升高，观察到bgh2中GhLTI65的上调可能是由GhBGH2-GhGLK1相互作用引起的。最后，使用GhBGH2、GhGLK1和G-box元件进行了双荧光素酶测定。荧光素酶活性表明GhBGH2抑制GhGLK1的转录激活，降低盐响应基因的表达。

图5. GhBGH2通过与GhGLK1转录激活结构域相互作用来抑制盐相关基因的转录

为了研究 GhGLK1 的遗传变异并确定与耐盐性相关的等位基因，我们使用CottonMD数据库分析了其单倍型，该数据库包括来自全球不同地区的4,180种棉花种质。在GhGLK1的2-kb上游和下游区域以及编码序列中，我们鉴定了39个SNP，其中11个位于编码区，包括4个错义突变，4个位于剪接位点或内含子区域。单倍型分析将这些SNP变异分为四种主要类型。Hap-0（n = 1,697）和Hap-1（n = 1,516）是棉多毛的主要单倍型，而Hap-2（0）和Hap-3（37）很少见（n = 3）。相比之下，Hap-0、Hap-2和Hap-3合计占G. barbadense的99.4%，Hap-1仅占0.6%。

进一步分析表明，陆地棉中的Hap-3主要存在于来自中国和美国的野生物种和地方品种中，而栽培种质以Hap-0和Hap-1为主。值得注意的是，在由来自中国北部和西北部干旱和半干旱地区的种质组成的G3组中，这些单倍型的分布明显偏斜，Hap-1占78.8%，Hap-0占21.2%。这表明优越的GhGLK1单倍型可能已被选择性地用于干旱易发环境的育种进程。基于这些发现，我们从携带不同单倍型的G3组中选择了种质进行进一步分析。对从Hap-0和Hap-1中随机选择的五种材料进行测序，发现Hap-1种质中存在CAG-C缺失突变。RT-qPCR进一步证实Hap-1与GhGLK1表达的显著增加有关。200 mM NaCl处理下的耐盐性测定表明，与Hap-0相比，Hap-1种质表现出显著更高的耐盐性。在NaCl处理后，Hap-1种质显示出GhGLK1表达的显著上调。此外，对随机选择的10株植物进行酶促测定表明，与参考组相比，Hap-1种质具有更高的SOD和CAT活性。

图6. GhGLK1单倍型分析及其在耐盐性中的作用

最后，文章提出了一种调控模型，其中GhBGH2在正常条件下与GhGLK1的C端GCT盒相互作用，抑制其对下游耐盐基因的转录激活，这些基因仍处于低表达水平。在GhBGH2敲除后，这种抑制被解除，使GhGLK1能够激活一组耐盐相关基因，从而增强植物耐盐性。此外，我们的遗传分析发现了CDS6上游的缺失突变，该突变可能会改变切割识别位点序列，最终导致GhGLK1表达增加并相应地激活耐盐基因。

图7. GhBGH2-GhGLK1调控模块介导棉花的耐盐性

中国农业科学院国家南繁研究院/生物所博士后王裴林，生物所/浙江师范大学联培硕士生王佳敏以及烟草所助理研究员斯欢为论文的共同第一作者。中国农业科学院国家南繁研究院/生物所程红梅研究员，郭惠明研究员，以及浙江师范大学马伯军教授为论文的共同通讯作者。该工作得到了生物育种重大专项（2023ZD04039）、海南省自然科学基金青年基金（325QN512）、南繁专项（YBXM2415）等项目的资助。

原文链接：http://doi.org/10.1111/pbi.70300